Сорбенти для афінної хроматографії.

Предыдущая10111213141516171819202122232425Следующая

Сорбентами для афінної хроматографії в основному є полімери, які використовуються для гельпроникаючої хроматографії, після цілеспрямованої модифікації (агарози, поліакриламіди, целюлози, пористе скло).

Найважливіший параметр при модифікації вихідних матриць є об'ємна концентрація, що відповідає угрупованню, яка, як правило, вибирається емпірично. Другий найважливіший параметр - стабільність нанесеного афінату в процесі сорбції - елюації. Якщо афінатами є білки, наприклад, поліклональні чи моноклональні антитіла, білкові і пептидні інгібітори, то стабільність шару афінату можна підвищити, проводячи додаткову міжмолекулярну зшивку. Концентрацію зливаючого агента (наприклад, глутарового альдегіду) потрібно вибирати з урахуванням необхідності уникнути істотної зміни конформації зшитих білків, що часто приводить до втрати афінату.

При виборі вихідного сорбенту приходиться приділяти увагу скороченню розмірів доступних областей у порах після введення в них протяжних афінатів. Тому матриці для біоспецифічної хроматографії з об’ємними афінатами повинні мати діаметри пор, які перевищують в 3-5 разів суму хроматографічних діаметрів макромолекул комплексів антиген-антитіло, білок-інгібітор і т.д..

При використанні білків у якості афінатів потрібно враховувати гетерогенність сорбційних центрів, обумовлену такими факторами, як гетерогенність білків до приєднання (вплив протеаз і денатурації, зміна структури і властивостей афінатів у процесі приєднання), а також у процесі поділу. Цей фактор виявляється особливо суттэвим з точки зору впливу навантаження на стовпчик як при сорбції, так і при виборі умов десорбції.

Сутність методу біоспецифічної хроматографії полягає в тому, що між одним або обмеженим числом білків-ферментів з безлічі наявних у фракційній суміші і полімерним сорбентом утворюється досить стабільний зв'язок, у результаті чого ці білки з розчину переходять на нерозчинний сорбент, що підвищує його селективність.

Висока селективність біоспецифічних сорбентів забезпечується тим, що в якості лігандів використовуються речовини, специфічно взаємодіючі з активним центром виділюваного ферменту. Центром зв’язування служать приєднувальні до полімерним матриць субстрати, їхні аналоги, оборотні інгібітори, коферментн, антитіла й інші речовини, звичайно названі лігандами.

Таблиця 3.

Очищені препарати Ліганди
Ферменти Субстратний аналог, інгібітор, антиген, вірус, антитіла
Гормони, вітаміни Рецептор, білок-переносник

Другим компонентом біоспецифічного сорбенту є полімерна матриця, до якої приєднується ліганд. Матрицею може бути будь-який полімер, у тій чи іншій мірі задовільнячи наступні вимоги:



- великопористість гелевої структури;

- гідрофільність, що забезпечує гарну взаємодію її з водою і відсутність неспецифічного зв’язування білків по гідрофобних центрах;

- відсутність у структурі зарядженних груп;

- здатність полімеру легко активуватися визнвченими хімічними агентами.

Вказаним вимогам відповідають: синтетичні полімери -поліакриламіди, сферони, а також великопористе скло і силікагелі.

Зазвичай хроматографічний процес складається з послідовно мінливих етапів сорбції, видалення несорбованих білків і елюациї сорбованих ферментів.

Великі перспективи відкриває використання моноклональних антитіл для приготування афінних гелів. Досить 4,0-5,0 антитіл, щоб приготувати 1 л афінного гелю. Такі гелі успішно застосовують для виділення із середовища культивування тваринних клітин, наприклад, гормону росту людини - самототропину й інтерферону.

Направлений синтез біоспецифічних сорбентів і вибір режимів афінної хроматографії дозволяє домогтися таких високих ступенів очищення БАР, які недоступні для інших хроматографічних прийомів. За одну стадію ступінь очищення може досягати 102-103 разів.

По своїй природі афінна хроматографія є варіантом адсорбційної хроматографії і її основні закономірності близькі оберненофазній і іншим видам адсорбційної хроматографії. Використовуючи рівняння

,

можна показати, що втримання БАР відбувається тільки за умови , коли концентрація іммобілізованого афінату більше константи дисоціації комплексу фермент-афінат, наприклад, відносне утримання при = 1 моль/л можливе при величині константи дисоціації моль/л. Очевидно, що при використанні афінатів з більшою величиною необхідно підвищувати концентрацію іммобілізованого афінату. Навпаки, при використанні афінатів з дуже малими величинами можна одержати ефективно утримуючі сорбенти навіть при невеликих концентраціях афінатів.

Електрофорез.

Електрофорезом називають поділ БАР завдяки різній швидкості їхнього переміщення в електричному полі. Постійна швидкість досягається частинкою з зарядом q, у рідкому середовищі під впливом електричного поля з напруженістю Е, визначається балансом

.

Для глобулярних білків можна використовувати закон Стокса в застосуванні до опору сфери частинки, що має радіус і рухається в ньютонівській рідині з в'язкістю :

так, що .

Оскільки в загальному випадку кожний білок має свій власний, тільки йому результуючий заряд, то накладання електричного поля приводить до того, що різні білки рухаються з різними швидкостями. Таким шляхом суміш декількох білків можна розділити на індивідуальні компоненти. За допомогою зміни рН можна регулювати електрофоретичну рухливість білка. Якщо рl даного білка менша рН середовища, то його заряд і швидкість будуть негативними. Навпаки, білки з рl > рН будуть рухатися в позитивному напрямку. Цей принцип покладений в основу одного з методів визначення рl білків і інших речовин; у градієнті рН рl білка дорівнює рН, при якому його електрофоретична рухливість дорівнює нулю.

У методі електрофорезу в потоці рідка фаза рухається перпендикулярно направленню електричного поля, що дозволяє здійснювати неперервний поділ. При електрофорезі в гелі на рух молекул БАР впливають процеси адсорбції і десорбції, а також опір дифузії.

Кристалізація.

Процес утворення і росту кристалів з розчинів і газової фази називають кристалізацією. Зазвичай речовини мають строго визначені кристалічні ґрати, за винятком поліморфних речовин. Ряд речовин утворять кристалогідрати, причому кількість включених молекул води залежить від температури. Для утворення кристалів з розчинів необхідно перенасичення, обумовлене різницею вихідної концентрації і рівноважної концентрації насичення (граничної розчинності ). Кристалізація відбувається, коли перехід речовини з рідкого у твердий стан супроводжується зменшенням вільної енергії системи Ф, тобто

,

де р - щільність зародку кристала;

V і F - його об'єм і поверхня;

М - його молекулярна маса;

φ2 і φ1 - хімічні потенціали вихідної і нової фаз;

σ - міжфазний поверхневий натяг.

Для одержання крупнокристалевого порошку кристалізацію проводять при малому перенасиченні, у розчин уводять затравочні кристали, дрібні кристали видаляють у процесі кристалізації, кристалічний продукт повторно оброблюють у насиченому розчині (при цьому дрібні кристали розчиняються), вводять у розчин сторонні домішки, підвищують температуру (обмежено).

Методи кристалізації: випарювання розчинника (ізотермічний), охолодження гарячих розчинів (ізогідричний), одночасне охолодження і випарювання (комбінований), додавання в розчин інших речовин, що знімають розчинність (висолювання), вимерзання.

Схеми кристалізації: однократна (з повним поверненням маткового розчину і періодично повним зливом, з частковим його поверненням, з частковим поверненням після додаткового випарювання і кристалізації), дворазова з такими ж маніпуляціями маточним розчином, причому на злив дають матковий розчин після першого кристалізатора, а після другого - насичений матковий розчин повертають у перший кристалізатор.

У фармацевтичній промисловості кристалізацією виділяють тверді речовини з їхніх розчинів, розділяють суміші речовин на фракції й очищають їх від домішок. Для дуже глибокого очищення термолабільних речовин слідувало б використовувати зонну плавку, для поділу ефтетичних розплавів чи речовин з низькими коефіцієнтами розподілу - екстракціонну кристалізацію. При поділі ефтетичних і азеотропних розплавів доцільно сполучити процеси кристалізації і ректифікації.


5832208920787826.html
5832299740206984.html
    PR.RU™